Doku Mühendisliği Prof. Dr. Kutlu Sevin

Doku Mühendisliği
Yazar: Prof. Dr. Kutlu Sevin

Doku mühendisliği son yıllarda Estetik Plastik ve rekonstrüktif Cerrahi alanında önemli bir uğraş konusu haline gelmiştir. Çeşitli nedenlerle oluşan doku kayıplarının rekonstrüksiyonu için primer kapatmadan, greftlere, yakın ve uzak fleplerden son aşama olarak mikrocerrahi yöntemler ile serbest doku aktarımına uzanan cerrahi işlemler, matür dokuların fiziksel olarak değiştirilmesi ve nakli gerçekleştirilmiştir. Plastik cerrahide yeni bir aşama olarak kabul edilebilecek doku mühendisliği, dokuların hücresel ve moleküler düzeyde değiştirilmesini sağlar.
Doku mühendisliği, geleneksel biyomedikal araştırmalardan elde edilen bilgileri klinikte doku replasmanına uyarlayan özel bir araştırma alanıdır. Mühendislik ve yaşam bilimlerinin prensiplerini; doku fonksiyonlarını iyileştiren , koruyan veya onların yerini alan biolojik yer tutucuların geliştirilmesine uygulayan disiplinler arası yaklaşım olarak tanımlanabilir. Doku mühendisliğinin başlıca amacı, plastik cerrahinin gelişimi boyunca kullanılan cerrahi işlemler sonucunda görülen morbidite ve skar gibi sorunlar olmadan laboratuar koşullarında kayıp dokuyu rekonstrükte edecek dokuların oluşturulmasıdır.

DOKU MÜHENDİSLİĞİNİN KLİNİK UYGULAMALARI

Klinik uygulamada temel prensipler 1) Doku defektinin dikkatle belirlenmesi 2) Kayıp dokunun yerine konması için uygun bir tasarım yapılması 3) Yeni dokunun kontrollü bir şekilde fabrikasyonu 4) Doku mühendisliği ile elde edilen dokunun defekte başarıyla aktarımı 5) Elde edilen yeni dokunun kalıcı olması olarak sayılabilir. Klinik uygulanmada amaç , uygun süre içinde iyileşme, maksimum fonksiyonel ve estetik restorasyon,ve minimal morbiditedir.

Genel Olarak Doku Mühendisliğinin Aşamaları

• Kullanılacak hücrelerin elde edilmesi,
• Bu hücrelerin kültür ortamında çoğaltılması
• Taşıyıcı iskelet üzerine ekilmesi
• Taşıyıcı iskelet üzerine tekrar kültüre edilip istenen üç boyutlu yapıyı kazanması
• Hastaya aktarımı

Biyomateryaller
İnsanda ilk implantasyon materyallerinin geliştirilmesi,1960’larda gerçekleşmiştir. Bu materyaller, biyolojik olarak “inert” kabul edilirler, yani belirgin doku yanıtı uyarmamaktadırlar. Cronin ve Gerow ‘un ilk kez tanıttıkları silikon jel meme implantları bunlara örnek olarak verilebilir.
İkinci kuşak biyomateryaller, ekstrasellüler matrix ile kimyasal olarak etkileşebilecek şekilde tasarlanmaktadır. Bu materyaller ilk kez 1970’li yıllarda tasarlanmıştır, bunlar içinde cam ve kalsiyum seramiklerinin olduğu kemik replasman materyalleri sayılabilir. Yine biyolojik olarak yıkılan sentetik polimerler, emilebilen sütür materyalleri ve kemik fiksasyon plakları bu grup içindedir. Biyolojik olarak yok edilebilen sentetik materyallerin hücrelerin tutunması ve doku oluşumuna yön vermesi için bir “taşıyıcı iskelet” (SCAFFOLD) rolü oynayabileceği fikri doku mühendisliği alanını başlattı. Günümüzde biyolojik sistemlerde özel moleküler yanıt oluşturabilecek üçüncü kuşak biyomateryallerin geliştirilmesi için yoğun çalışmalar mevcuttur.
Doku mühendisliğinde biyomateryallerin, çok önemli rolü vardır. Doku kalıbını sağlayan çemberler , doku iskeleti, biyoaktif madde dağıtan araçlar gibi implante edilen cihazlar için gereklidirler.
İmplante edilen kalıplar, istenen fonksiyonun özel üç boyutlu şekle bağlı olduğu yapıdaki dokular için kullanışlı olmaktadır. Kalıp, önceden belirlenmiş şekillerde doku oluşumuna rehberlik edebilir, ve kan akımının bulunduğu kaynaktan yeni oluşacak dokuya yönlendirilmesini sağlar ve böylece yeni oluşan dokunun cerrahi aktarımını mümkün kılar. Doku fabrikasyonu için kullanılan alanda katı duvarlı çemberler, biyoaktif materyalleri bünyesinde yoğunlaştırıp lokalize eder.
Biyomateryallerin doku mühendisliğinde diğer önemi ise “taşıyıcı iskelet” olarak kullanılmalarıdır. Yapı iskelesi olarak kullanılacak materyal için istenen temel özellikler arasında biyouyumlu, yok edilebilir, mekanik bütünlüğü ve doku iletimini sağlayabilir olması sayılabilir. Vücutta normalde bulunan ve “framework” görevindeki materyaller, örneğin hyalurinik asit, glikozaminoglikanlar, kollagen, polisakkarit (çitosan), fibrin bu amaçla kullanılabilir ve bunların ince bağırsak mukozası ya da dermisten hazırlanan asellüler karışımları doku mühendisliğinde kullanılabilir.
Doku iskeleti olarak kullanılabilecek semi sentetik maddeler içinde (biyolojik yapıda var olan maddelerin sentetik maddelerle karışımları) veya sentetik maddeler (tamamen doğal olmayan maddeler) olabilir. Sentetik polimerlerin daha esnek tasarımlara olanak sağlayabilmeleri, içerik ve yapıları isteğe göre özel olarak üretilebilmeleri gibi avantajları vardır. Bazı polimerler, biyolojik koşullarda örneğin vücut sıvılarına maruz kalınca veya hücresel yıkım veya enzimatik yıkıma uğrayabilmektedirler. Bunu gidermek için küçük delikler (por’lar) aracılığıyla geçirgenik ve hidrofobik niteliklerin, ko-polimer oranı ve kristallik gibi özellikler eklenerek biyolojik yıkımdan bir miktar korunmaları sağlanmaktadır. Biyoyıkılabilir polimerler, kalsiyum seramikleri ve her ikisinin kombinasyonları delikli materyal özelliğinde üretilip yapı iskelesi olarak kullanılabilir.
Materyaller, yüzey özelliklerini ve kompozisyonu değiştirecek şekilde biyoaktif moleküller ile modifiye edilebilir. Biyolojik ortamda parçalanırken biyoaktif materyaller halinde ortama salınan biçimde de üretilebilirler. Bu amaçla 100 mikrometre çaplı mikropartiküller içerecek şekilde oluşturulabilirler.
Biyomateryaller yüzeyde hücreler ve ekstrasellüler matris ile temas halindedirler. Sentetik ve doğal maddelerin yüzey özellikleri, elektrik, topolojik ve kimyasal olarak değiştirilebilir. Materyalin yüzeyine çeşitli moleküllerin eklenmesi ile adherans ve hareketlerini etkilenebilir. Kalsiyum mineralleri ile kaplama, parçalanabilen polimerlerin kemik dokusu ile daha uyumlu olmasını sağlayabilir. Kollajen lifler gibi doğal olarak var olan bazı maddeler spesifik hücre adhezyonunu sağlayan kenarları taklit etmek amacıyla kullanılabilir. Hücre fonksiyonları, yüzey mühendisliği ile özel büyüme faktörleri salgılayacak şekilde kontrol edilebilir. Yapı teknolojisi içinde mikrotemas printing, laser fotolitografi, mikro sıvı kanalları gibi işlemler , sentetik materyaller üzerine hücre ekimi işleminin topografisini kontrol etmek için uygulanmaktadır.

Biyoteknoloji
Biyoteknoloji alanı, bitki hayvan ve insan hücreleri dahil tüm organik hücrelerin fonksiyonlarını anlamak, onları değiştirmek ya da yönlendirmek için çok sayıda teknolojiyi bünyesinde barındırmaktadır. Hücre nakli, büyüme faktörü salınımı, gen terapileri gibi biyoaktif komponentleri destekleyen metodlar, biyoteknolojinin odağını teşkil eder.
Hücre bazlı teknolojiler içinde hücre nakli ve in vivo hücre iyileşmesine yönelik işlemler bulunmaktadır. Hücre naklinin temel planı hücrelerin toplanması, bunların kültür ortamında büyümeleri ve doku fonksiyonunun düzeltilmesi amacıyla alındıkları dokuya (vericiye) geri aktarımı olarak ifade edilebilir. Bazı yaklaşımlarda hücreleri, in vitro koşullarda doku oluşturduktan sonra geri vermek varken, bazılarında bu hücreleri in vivo olarak doku oluşumuna rehberlik edecek sentetik bir yapıya ekip eş zamanlı olarak alındıkları ortama geri verme söz konusudur. Kök hücreler, pluripotent özellikleri ve kültür ortamında çoğalabilmeleri nedeniyle bu amaç için elverişlidirler ve kültür ortamındaki değişikliklerle farklı hücrelere dönüşebilirler. Doku mühendisliği kavramının ortaya atılmasından önce hücre transplantasyonu genelde hücrelerin doğrudan enjeksiyonu ya da bunların ekstrasellüler matriks proteinleri ( örneğin kollajen) üzerine yerleştirilmesi üzerine yoğunlaşmıştır. Doku mühendisliği ile bu yaklaşımın bir adım ötesine geçilmiş ve implantasyon öncesinde bir iskele üzerinde üç boyutlu kültürler elde edilebilmektedir. Hücre yaşaması için difüzyon sınırlılığı nedeniyle bu yöntemde tek başına yüksek vaskülarize dokuların elde edilmesi zordur. Hücre nakli, hücre yaşamını destekleyecek kapiller yatakların prefabrikasyonu gibi yöntemlerle zenginleştirilmelidir.
Vaskülarize doku elde edilmesi için özelleşmiş doku oluşumu ve anjiogenez gereklidir. Büyüme faktörleri bu nedenle doku mühendisliği için oldukça önemlidir. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan büyüme faktörlerine örnek olarak fibroblast growth factor –2 (FGF-2 veya FGFb) verilebilir. Bu büyüme faktörü, hem osteoblast öncü hücrelerinin proliferasyon ve diferansiyasyonunu uyararak kemik oluşumunu hem de anjiogenezi uyarır. Bu ikili etkisinden dolayı üzerine hücre ekilmiş hidroksiapatit seramiklerinde, sentetik polimer iskelelerde ve izole damarlar üzerinde kaplanmış kemik oluşumunda kullanılmaktadırlar. Benzer şekilde Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) de anjiogenez ve osteogenezde etkindir.
Genetik mühendisliği ile hücre teknolojisinin birleştirilmesi fonksiyonel olarak daha iyileştirilmiş doku replasmanlarının elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Doğal dokuların davranışlarını değiştirerek önemli büyüme faktörlerinin daha etkin rol oynamasını sağlanabilir ve “yaşayan” protein salgılayan implante edilebilir materyaller elde edilebilir. Genetik olarak modifiye edilmiş allojenik hücreler mikroenkapsülasyon tekniği kullanılarak nakil edilebilir. Fibroblastlar gibi daha kolay büyüyen hücreler, modifiye edilerek daha zor sentezleyen bazı hücrelerin yaptıkları elemanları sentezler hale gelebilmektedir.

ERİŞKİN KÖK HÜCRELERİNİN REJENERATİF TIPTA KULLANIMI
Kök hücreler, pluripotent yani birçok klona farklılaşabilmeleri ve kendi kendine rejenere olabilme özellikleri yanı sıra uzun ömürlü olmaları nedeniyle doku mühendisliğinde giderek daha fazla ilgi çekmektedir. Buna rağmen kök hücrelerin biyolojik davranışları halen net olarak anlaşılamamıştır. Kök hücre kullanımı basit olarak iki aşamada incelenebilir: İlk aşamada organ ya da dokunun oluştuğu klona farklılaşır. Daha sonra dokunun fonksiyonel gereksinimine göre üç boyutlu mimari yapıya “monte edilir”.Bu karmaşık aşamalara ek olarak her basamakta dokuya ve işlem sırasına özel düzenleyici faktörlerin etkisi vardır.
Kök hücreler, temel olarak embriyonik veya erişkin kökenlidir. Embriyonik kök hücreler (EKH) preimplantasyon aşamasındaki blastokistin iç hücre tabakasından elde edilirler, erişkindekiler ise esas olarak kemik iliğinden elde edilebilir. Multipotent olduklarından çok çeşitli alanlarda kullanılabilmektedirler. Örneğin, kültür ortamının manipulasyonu sırasında yapılan gözlemlerde kök hücrelerin hematopoetik hücrelere, adipositlere, kas hücrelerine, kondrositlere ve diğer birçok hücreye dönüştükleri gözlenmiştir. Bu olumlu özelliklerin yanı sıra hücre stabilitesi, onkojenik potansiyel ve etik nedenlerle bu EKH çalışmalarına olan ilgi sınırlanmıştır. EKH’lerin aksine kemik iliği kökenli kök hücreler uzun yıllardan beri çalışılmakta ve kemoterapi ve radyason sonrasında kemik iliği rekonstrüksiyonu için kullanılmaktadırlar. Kemik iliğinde iki ayrı kök hücre populasyonu vardır: hematopoetik kök hücreler, kan hücrelerinin gelişimi ile ilgiliyken mezenşimal kök hücreler (MKH) çeşitli bağ doku elemanlarını kemik, kartilaj, adipo ve kas dokularına in vivo ve in vitro dönüşebilmektedir.
EKH’lere benzer olarak MKH’ler kültür şartlarını ve biyokimyasal çevreyi değiştirerek farklı hücrelere dönüşebilirler. Ne var ki klinikte pratik uygulamalarda bazı engeller söz konusudur. Örneğin alınması sırasında ağrı, morbidite, az sayıda hücre elde edilmesi sayılabilir. Kemik iliğinin yanı sıra erişkin kök hücreleri için ek kaynaklar için progenitor hücre populasyonu da dokunun devamlılığının korunması ve onarımı için kullanılabilir.
Ohgushi ve Caplan (3) mezenşimal progenitor hücrelerin kemik iliğinden veya periosttan implante edilen materyallere göç edebildiklerini ve osteojenik farklılaşmaya uğradıklarını göstermiştir. Ringe ve ark , (4) 2002 yılında yayınladıkları bir çalışmalarında MKH’nin yenidoğanda 100000 kemik iliği hücresinde 1 iken 50 yaşındaki bireyde 0,25’e, 80 yaşında ise 0,05’e düştüğünü gösterdiler. Bu bulgular nedeniyle araştırmacılar kemik iliğinden izole edilen progenitör hücreleri kültür ortamında çoğaltıp defektli organa yerleştirmeyi denemektedirler. Javiswal (5), MKH kullanarak askorbik asit, deksametazon, beta-gliserofosfat ile zenginleştirilmiş kültür ortamın in vitro osteojenik farklılaşmayı gerçekleştirdi. Bunun yanı sıra diğer bir çalışmasında bu multipotent hücrelerin adiposit klona veya osteojenik klona farklılaşmalarının mitojen ile aktive olan bir proteinkinaz’a bağlı olduğunu gösterdi. Yoshikawa (6) osteojenik olarak zenginleştirilmiş kültür ortamında rat MKH’ni por içeren hidroksiapatit içine yerleştirmiş ve bunu subkutan olarak implante etmiştir. İmplantasyondan 1 hafta sonra kemik oluşumu ve maturasyonu gözlendi. Ohgushi, rat uzun kemiğinde 8 mm lik bir defektin kalsiyum bazlı seramik üzerine yerleştirilen MKH ile onarıldığını gösterdi
Kıkırdak dokusu için yapılan araştırmalarda total kalça protezi uygulanan hastaların femur başından izole edilen yüksek yoğunlukta (1,5x10*6) insan MKH’ni içeren hücre pellt’lerini basınç altında polilaktik asit polimerleri üzerine yerleştirmişler ve proteoglikandan zengin ekstrasellüler matriste kondrosit benzeri hücrelere farklılaştığı. ortaya konmuştur. Bunun yanı sıra Sekiya ve ark. (7) insan erişkin kemik iliği stromal hücrelerinden in vitro kıkırdak gelişimini göstermişlerdir. Wakitani, (8) 2002 yılında yaptıkları bir çalışmada kemik iliği kökenli kök hücrelerini önce kültürde çoğaltmış ve kollagen gel iskelete yerleştirmiş, daha sonra hastalarındaki kıkırdak defektlerine aktarmıştır, sonuçta MKH’nin aktarımı ile daha iyi iyileşme sağlanmıştır; ancak klinik fayda açısından ele alındığında belirgin düzelme saptamadıklarını belirtmektedirler.
Tendon onarımları için 1998’de Young ve ark . nın yaptıkları bir çalışmada tavşan kemik iliği kökenli MKH ni tip 1 kollagen içeren jel içine implante etmiş ve bunun tendon onarımına olan etkisini incelemişlerdir. Sonuçta biyomekanik, yapı ve fonksiyon açısından iyileştirici etkinin bulunduğunu göstermişlerdir. Awad ve ark . da benzer deneysel çalışmayı yapmış; ancak biyomekanik özelliklerde iyileşme saptarken yaranın mikroyapısında belirgin değişiklik olmadığı sonucuna varmışlardır.
Kemik iliği kökenli MKH’lerin iskelet kası, düz kas ve kalp kasına farklılaşabileceği bilinmektedir. Bu, travma, vasküler yetmezlik, tümör rezeksiyonu sonrasındaki kas kayıplarında ve dejeneratif kas hastalıklarında kasların rejenerasyonu için üzerinde yoğun olarak çalışılan konulardandır. Esas ilgi kalp kası rejenerasyonu üzerinde odaklanmıştır, akut MI ve ekstremite iskemisi sonrasında kök hücre kullanımı ile ilgili Faz 1 çalışmalar yapılmaktadır.

İskelet Olarak Kullanılan Doğal Materyaller

a) Kollagen
İlk olarak örgülü Dacron ile desteklenmiş Tip1 kollagen üzerine kültüre edilmiş sığır endoteli, düz kas ve fibroblastlar yerleştirilmiş ve tekrar oluşum için kültüre edilmişlerdir. Sonuçta üzerindeki endotel hücrelerinin yaşadıkları da Von Villebrant faktör ve prostasiklin salgılamaları ile doğrulanmıştır. Yine de bu modelin dayanıklılığı doğal damar greftlerine göre daha zayıftır. (Max. Burst strength 325 mm Hg olarak ölçülürken Bu değer, doğal koroner arterde 5000 mmHg dır.) Diğer çalışmalarda domuz dokusundan elde edilen desellülarize kollajen iskeleler de denemiştir. Domuz ince bağırsak mukozası izole edilerek hücreden uzaklaştırılır ve esas olarak kollgenden oluşan matriks haline getirilir. Bu yapının daha dayanıklı olduğu, daha iyi kompliyansa sahip olduğu gösterilmiştir. Bu materyallerde esas problem, bunların da bir miktar trombojenik özelliklerinin olması ve xenogenik materyale olan immun yanıttır.

b) Desellülarize arteriyel matris:
Xenogenik arteriyel matris konduitler de geliştirilmektedir. Bu yaklaşımda damarlar, tripsin ve etilendiamintetraasetik asit ile muamele edilip hücrelerinden uzaklaştırılmaktadır. Bunun için domuz karotis arteri kullanılır ve desellülerize edildikten sonra safen venden izole edilen insan endotel hücreleri ve kasları bunun üzerine ekilir. Fizyolojik koşullarda pulsatil akıma maruz bırakılınca başarıyla tek katlı endotel tabakası oluşturmuştur. Bu xenogreftlerin de benzer şekilde immun yanıt oluşturma riski ve hastalık taşıma potansiyelleri de önümüzdeki engellerdendir.

c) Hücre “tabakası” (cell sheets)
L’Heureux ve ark nın yaptığı bir çalışmada (8) İnsan umbilikal veninden elde edilen düz kaslar ve insan deri fibroblastları süper akışkan nitelikte ve hücre tarafında sentezlenen ekstrasellüler matriks içeren tabakalar oluşturacak şekilde 5 hafta süreyle inkübe edilmiştir ve Bu, tabakalar yuvarlanarak düz kas tabakası ve dışta adventisya tabakası oluşturulmaya bırakılmıştır. 8 hafta süreyle bu iskele, kültüre edilmiş ve lümene endotel hücreleri ekilmiştir ve doğal bir arterin her üç tabası da elde edilmiştir. İn vivo ortamda hastaya aktarıldıklarında, implantasyonun 1. haftası sonunda %50 patens oranı saptanmıştır. Bu yapı tamamen insan hücreleri ve insan ekstrasellüler matriks proteinleri içermektedir. Bu örnekte de trombüs oluşumu gözlenmiştir, ve bu yapının gücü adventisya tabakasındadır oysa normal dokuda media tabakası esas olarak bu yükü taşımaktadır. Bunun yanı sıra 12 haftalık bekleme süresi de bir dezavantajdır.

Sentetik polimer İskeletler
Doğal materyallerin mekanik özelliklerinin zayıf olması nedeniyle sentetik materyallerin geliştirilmesi yönünde çalışmalar artmıştır. Biyolojik olarak emilebilen sentetik polimerler, gelişen üç boyutlu doku için geçici bir çevre oluşturacak şekilde tasarlanabilir. Bu amaçla poliglikolik asit , polietilen glikol gibi maddelerden iskele oluşturulup mekanik ve biyo uyumları incelenmektedir. Bu materyallerin en önemli özellikleri emilebilir yapıda olmaları ve mekanik kuvvetlerinin doğal materyallere göre daha iyi olmalarıdır.

Vasküler doku mühendisliğindeki potansiyel problemler
Greft patensinin önündeki en büyük sorun “tromboz” dur. Bu nedenle son dönemde yapılan çalışmalar daha çok trombozun önlenmesi üzerinde yoğunlaşmaktadır. Örneğin genetik mühendisliği ile antitrombotik faktörler salgılayabilen düz kas hücrelerinin endotel hücreleri ile ekimi gerçekleştirilerek greft patens oranlarını artırmaya yönelik çalışmalar vardır. Bir başka çalışmada güçlü bir trombosit agregasyon inhibitörü olan nitrik oksit kullanılmıştır. Nitrik oksit sentetaz 3 taşıyan virusle tranfekte edilen sığır düz kas hücreleri ile başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Alternatif gen terpisi olarak Vasküler Endoteliyal Büyüme Faktörü (VEBF) ile transfekte edilmiş vasküler hücrelerin kullanımı gündeme gelmiştir. Bu büyüme faktörü, endotel hücreleri için mitojen niteliktedir ve in vivo olarak anjiogenezi uyarmaktadır. VEBF ile transfekte edilmiş düz kas hücreleri, endotel hücre proliferasyon ve migrasyonunu in vitro olarak arttırdığı gösterilmiştir.

Özet olarak Küçük çaplı vasküler greftllerin doku mühendisliği önünde maliyet , süre, dayanıklılık, immunite gibi birçok problem dursa da sağlayacağı faydalar nedeniyle üzerinde yoğun olarak çalışılan konulardandır. Yakın gelecekte non trombotik özellikte ve yeterli mekanik güce sahip vasküler yapılar klinik çalışmalarda yerine alacaktır.

DERİ VE DOKU MÜHENDİSLİĞİ
Deri mühendisliğinin amacı, doğal derinin normal anatomi ve fizyolojisinin rejenerasyonudur. Otolog keratinosit kültürleri 20 yıldan uzun süreden beri klinik kullanımdadır. Günümüze kadar geçen zamanda kültüre suni deriler sadece kısmi olarak anatomik veya fonksiyonel yapıyı restore etmekte kullanılmıştır. Oysa, deri mühendisliğinin potansiyeli ve sınırları bunun çok ötesindedir.

Kültür Edilmiş Epidermal Otogreftler
İlk kez 1975’de ağır yanıklı hastada Rheinwald ve Green , insan keratinosit kültürü tekniklerini kullanmıştır. Bu otörlerin adıyla anılan keratinosit kültür metodu ile 1-5 cm2lik biopsinin 3 hafta sonunda %70 yanık alanı olan erişkinde ki deri defektini örtecek kadar otolog epitel sheet’i elde etmek mümkündür.

20 yıldan uzun süreden beri yanık hastaları, çok tabakalı ince sheet’te lokalize otolog keratinosit kültürleri ( Kültüre Epiteliyal Otogreftler –KEO-) ile tedavi edilmektedir. Bu deri greftleri kalıcı yara örtüsü sağlamaktadır. KEO kulanımındaki en büyük problem, yeterli kalitede greftleme için uygun hale gelmesi için 3-4 hafta gibi uzun zaman gerektirmesidir. Cerrahi olarak bu kırılgan KEO’nun manipulasyonu zordur, enfeksiyon riski vardır ve çok pahalıdır. Erken dönemde bu yapıların vücutta tutması, literatürde %49-80 oranında değişmektedir. Bunun yanı sıra yeni epidermis çok kırılgandır ve yıllar sonra bile üzerinde küçük travma sonrasında büller oluşabilmektedir.
Yaranın kendisinin uygun hale getirilmesi KEO’nun az olan iyileştirme potansiyelini arttırabilir. Bu amaçla yaradaki tanjansiyel debridmanlar, nekrotik dokuların uzaklaştırılması, ve defektin allojenik kadavra derisi gibi geçici dermal maddelerle örtülmesi uygulanabilir.
Kültüre epiteliyal sheet’lerin bir çok olumsuz yönlerine rağmen yeterli donör alanın olmadığı yaygın deri defektlerinde rutin olarak kullanılmaktadır.

Alternatif Keratinosit Uygulamaları
KEO yerine kültüre edilmiş yarı akışkan hücrelerin kullanımı son dönemde daha ilgi çekmektedir. Bu kavram, kontakt inhibisyonu olmayan hücrelerin daha fazla büyüme potansiyelleri ve yara iyileşme potansiyelleri olması temelinden yola çıkılarak oluşturulmuştur. Bu hipotez, yarı akışkan kültürlerde yüksek proliferasyon potansiyeli ve diferansiyasyon marker’larının az oranda ekspresyonunun görülmesi ile desteklenmektedir. KEO’lardan enzimatik yolla geçici süre için alfa6 beta4 integrinlerden uzaklaştırılmaları (Hücre adhezyonundan sorumlu moleküllerdir) mümkün olabilmektedir. Kültür sürecinde enzimatik basamağa müdahale için bazı doğal ya da sentetik materyaller kullanılarak keratinositler yarıakışkan olarak kültüre edilebilir, böylece enzimatik işlemlerden kaçınılarak istenen sonuca ulaşılabilir. Bu biyomateryaller içinde poliüretan membranlar, silikon kollagen membranlar, hyaluronik asitli membranlar, kollagen süngerle ve fibrin glue sayılabilir. Keratinosit migrasyonu, iyileşme sırasında reepitelizasyon işlemi için büyük önem taşımaktadır.
Diğer bir uygulama metodu da taşıyıcı araç olarak kültür vasatı veya fibrinin kullanıldığı tripsin ile ayrıştırılmış yarı akışkan hücrelerin kullanılmasıdır. Fibrin, yara iyileşmesi sürecinde doğal matriks elemanıdır ve hücrelerin yeniden düzenlenişinde çok iyi bir rehber olarak davranır.
Keratinosit hücre greftlemesi ile hücrelerin manipulasyonu daha kolaylaşmıştır. Allojenik kadavra derisi ile kombine edilince stabil yapıda neoepitel elde edilebilir. Allojenik epitel hücreleri atılırken dermal kısmı kısmi olarak integre olur ve dermal rekonstrüksiyon için taşıyısı iskelet gibi davranır, Kadavra deri kullanımındaki bir engel de hastalık taşıma olasılığıdır. Bu da klinik kullanımı sınırlandırmaktadır.
Deri replasmanına diğer bir yaklaşım da hem epiteliyel hem de dermal komponent içeren kompozit greft kullanımıdır. Bunlarla yapılan çalışmalarda bazal membran rejenerasyonunun dermis ve epidermisin interaktif süreç olduğunu göstermektedir. Keratinosit veya fibroblast ekilmiş farklı biyomateryaller, deneysel olarak dermis ve bazal membran komplekslerinin rejenerasyonuna yol açan olumlu özellikleri olduğu saptanmıştır. Tüm bu bulgular ışığında kültüre keratinositler, ekstrasellüler matriks ve kültüre fibroblastları içeren kombine suni deri geliştirilmiştir.

Dermal Taşıyıcılarla Kombinasyon: Tam Kat Deri Mühendisliği
KEO uygulamaların sonuçları incelendiğinde araştırmacılar epitel greftlerinin kalitesini arttırmak için dermal komponent eklenmesi üzerinde yoğunlaşmıştır. Fonksiyonel bir deri replasmanı, pür epidermal replasmandan daha faydalıdır. Çalışmalar, derimsi materyaller (skin substitudes) ile kültüre keratinositlerin greftleme öncesinde in vitro kombine edilmesi üzerinde yoğunlaşmaktadır. Dermal taşıyıcı iskelet olarak birçok materyal kullanılmıştır. Örnek olarak dermisten veya, kollajenden derive dilen kafesler verilebilir.
İn vitro çalışmalarda intakt bazal membranın , dermal yapının, ve canlı keratinositlerin önemi görülmüştür. Bunlara ek olarak kollajen ve glikozaminoglikanlardan oluşan dermal kafes geliştirilmesi ile her üç koşulun da sağlanması mümkün olmuştur. Matrikse fibroblast inokulasyonu ile keratinositler için daha uygun ortam oluşturulmuş ve deneyimli merkezlerde başarılı klinik sonuçlar alınmıştır. Bu tür kompozit greftler üzerinde yapılan çalışmalar ümit vericidir; ancak, bu yapıların difüzyon ile beslenmeleri için gerekli koşulların henüz çok iyi olmaması ve maliyet gibi aşılması gereken sorunlar vardır.
Yaranın onarımı yerine “rejenrasyonu” başlatmak için kültüre keratinositlerin dermal matriks ile doğrudan yara üzerinde kombine edilerek kullanımı üzerinde çalışmalar mevcuttur. AlloDerm’in dermal matrix olarak kullanıldığı deneysel çalışmalarda bu asllüler dermal greft, epidermisten ve dermis hücrelerinden yoksun bırakılmış dermal matrikse karşılık gelmektedir , bazal membran olarak kullanılmıştır ve hem domuz modelinde, hem yanık hastalarında bu yapı üzerine konulan kısmi kalınlıkta deri grefti başarıyla tutmuştur.
Gelecekte , mühendislik ile elde edilen derimsi materyallerin (skin substitudes) anatomi ve fizyolojisi daha iyi anlaşılacak ve bunlar otolog deri greftlerinin yerini alacaktır. Bunun yanı sıra derimsi materyallere eklenecek melanosit gibi diğer dermal hücreler ile daha iyi sonuçlar alınacaktır. En önemli hedef ise onarım yerine rejenerasyonu uyaracak derimsi materyallerin geliştirilmesidir.

KIKIRDAK VE DOKU MÜHENDİSLİĞİ
Kıkırdak, göreceli olarak basit kabul edilebilecek; ancak esas olarak proteoglikan , kollagen ve sudan oluşan ekstrasellüler matriks içinde yer alan kondrositlerce oluşmuş oldukça özel bir bağ dokusudur. Rejenerasyon potansiyeli yüksek olan kemik dokunun aksine kartilaj, onarım ve rejenerasyondan yoksundur. Beslenmesi, vasküler ağlar yerine difüzyon yoluyla gerçekleşmektedir. Buna rağmen kıkırdak, onarılacak alana kolaylıkla nakledilebilir ve bir çok rekonstrüksiyonda başarıyla kullanılabilir.
Kıkırdak, hücre nakli ve doku mühendisliği için çok uygun olan birkaç özelliğe sahiptir. Tek tip hücre yani kondrosit içermektedir. Kondrositler, içinde bulundukları ekstrasellüler matris de kollagen ve sülfatlı glikozaminoglikan gibi birçok makromolekülü sentezler. Kıkırdak bifazik bir materyaldir; yoğun kollagen ağdan oluşan solid matriks fazı proteoglikan jel içinde bulunmaktadır. İnterstisyel sıvı fazı, eklem kıkırdağına , proteoglikan matriks içinde su ve elektrolitlerin serbest akımı- nın sağladığı eşsiz viskoelastik yapıyı verir.
Kıkırdağın biyokimyasal içeriği özel kıkırdak yapılarının karşılaştığı mekanik faktörlerle yakından ilişkilidir. Eklem kıkırdağının basıncı emip eski haline gelecek şekilde düzenlenişi varken kulak yapısındaki elastik kıkırdak, şekil ve destek verecek şekilde sabittir. Defekte uygun yeni kıkırdak dokusunun mühendislikle elde edilmesi sırasında dokunun özellikleri ve mekanik gereksinimleri göz önünde tutulması ayrı bir önem taşımaktadır. Kıkırdak mühendisliğinde hedefler arasında, nonimmunojenik, istenen şeklin verilebileceği, resorbe olmayan otolog kondrositlerin oluşturduğu defekte uygun kıkırdak dokusu oluşturmak sayılabilir.
Geçen yüzyıldan günümüze kıkırdak defektlerinin onarıma ait en yaygın işlem vücudun diğer bölümlerinden alınan kıkırdak greftlerinin şekillendirilerek kullanımı olmuştur. Ne var ki tüm kıkırdak greftleri, alındıkları bölgenin özelliklerine bağlı olarak zaman içinde bir miktar resorbe olmakta ve istenen şekli yitirebilmektedirler. Bunun yanı sıra donör alan morbiditesi ve oluşacak skarlar da hastalar için ek problem getirmektedir. Bu olumsuz özellikleri nedeniyle araştırmacılar alloplastik materyallere yönelmiş ancak bu materyallerin kullanımı ile elde edilen doğal olmayan sonuçlar ve ortaya çıkan komplikasyonlar nedeniyle kıkırdak mühendisliği ilgili çalışmalar yoğunlaşmıştır.

Hücre Kaynakları
Kıkırdak mühendisliği için esas engel, hücrelerin sağlanmasıdır. Başarılı bir mühendislik için kondrogenezisi sağlayacak yoğunlukta hücrenin polimer yapıda taşıyıcı üzerine ekilebilmesi kıkırdak mühendisliği için çok önemlidir ve başarılı sonuç alınabilmesi için hücre tipi, hücre sayısı ve ortam kritik faktörlerdir.
Birçok canlı türünde yapılan deneysel çalışmalarda ekstrasellüler matrislerinden ayrılan kondrositlerin fenotipik olarak stabilitelerinin yitirdikleri gözlenmiştir.Tek tabaka halinde inkübe edildiklerinde plak üzerinde düzleşip, yayılıp fibroblast haline geldikleri bilinmektedir. Benya ve ark nın da yapıtıkları çalışmada (10) kulak kartilajından elde edilen kondrositlerin tek tabaka halinde inkübe edildiklerinde Tip 1 kollagen sentezinin giderek azaldığını ve Tip 1 kollagen sentezinin arttığını (fibroblastlarda ve bazı andiferansiye mezenşimal hücrelerdeki gibi) gözlemişlerdir.
Kondrositleri, doğal ortamlarındaki gibi üç boyutlu yapıda tutmak, hücrelerin doğal özelliklerini korumalarına ve kendi uygun ekstrasellüler matris içeriklerini sentezlemelerini sağlayabilir. Bonaventure ve ark. (11) Tek tabakalı kültürde “dediferansiye” olmuş insan kıkırdak hücrelerinin, tekrar kondrosit fenotipine dönüp tip 2 kollagen ve geniş agregasyonlu proteoglikan sentezleyebildiğini gösterdi. Tek tabakalı kültürde birkaç hücre bölünmesinden sonra bile kondrositlerin, in vivo ortamda tekrar eski fenotiplerine dönebileceği bilinmektedir. Fonksiyonlarının geri dönüşümü yanı sıra biyolojik olarak yıkılabilen hidrojen polimerleri içinde sferik şekillerini geri kazanabilirler karakteristik matriks moleküllerini üretebilirler.
Kondrojenik potansiyeli olan hücreler de doğru polimer ve uygun koşullar içinde kıkırdak gelişimini sağlayabilir. Örneğin, Mizuno ve ark.(12) demineralize kemik matriksi içeren tip 1 kollagen süngerler üzerine insan dermal fibroblastlarını ekmişler ve tip 2 kollagen içeren kartilaj benzeri doku elde etmişlerdir.
İnsan, tavuk, tavşan ve köpek mezenşimal kök hücrelerinde (MKH) yapılan birçok çalışmada kontrol altındaki in vitro koşullarda kemik, yağ tendon, kas ve kıkırdak benzeri dokulara farklılaştıkları gözlenmiştir. MKH’ni , transforming Growth Factor Beta (TGF beta), deksametazon, insulin like growth factor (IGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) gibi kondrojenik bir ortamda kültüre ederek kondrogenezis gerçekleştirilmiştir. Kondrogenezisin delili de ortamda kıkırdak ekstrasellüler matriks elemanlarının ve kondrositlere özel gen ekspresyonlarının saptanmasıdır. Tüm bu bulgular, faklı kaynaklardan gelen hücrelerin kıkırdak mühendisliği için kullanılabileceği fikrinin doğmasına yol açmış ve birçok denysel çalışmaya yön vermiştir.
Allojenik veya xenojenik kaynaklı kondrositler de kıkırdak mühendisliği için kullanılabilir. Allojenik veya xenojenik kıkırdakların bütün olarak kullanımı klinik olarak başarılı olmasa da bu kaynaklardan izole edilen kondrositlerden doku mühendisliğinde faydalanılabilir. Ancak bu hücrelerin ekstrasellüler matriksi uzaklaştırıldığında major histokompatibilite antijenlerinin ekspoze olması ve bunların oluşturacağı immun yanıt araştırıcıların karşısındaki problemlerden biridir. Bunun için taşıyıcı iskeletin; hem kondrositlerin kendi estrasellüler matrikslerini oluşturmasını sağlayan hem de immun yanıttan koruyan yapıda olması beklenir.

Taşıyıcı İskeletler
Erozyon ya da rezorpsiyonu kontrol edilebilen doğal veya sentetik polimerler in vivo ve in vitro kıkırdak mühendisliği için kullanılabilir. Örneğin intersellüler alanda biriken ekstrasellüler matriks proteinlerinin miktarı ile orantılı olarak yok edilen polimerler kıkırdak oluşturmak için kullanılabilir.

a)Sentetik Polimerler
Polyesterin poli alfa hidro esterleri kıkırdak mühendisliğinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunlara örnek olarak poli L laktik asit (PLLA), poliglikolik asit (PGA) ko-polimer poli L laktik ko-glikolik asit verilebilir. Bu polimerler kafes şeklinde yüksek geçirgenliğe sahip olarak oluşturulabilir ve böylece besleyici maddelerin ve hücresel atıkların rahatça değişimine izin verir. PLLA ve PGA toksik olmayan metabolitlerine hidroliz yoluyla parçalanırken yıkım hızları da ayarlanabilir. PLLA daha hidrofobiktir, daha yavaş parçalanır. Özellikle PGA polimerleri ile in vitro çok sayıda çalışma mevcuttur. Örneğin tavşan diz eklemi defektlerinde artiküler kondrositlerin PGA üzerine ekimleri sonrasında yeni matriks oluşumu gözlenmiştir ve in vivo olarak biyouyumlu polimerler üzerinde yeni kartilaj oluşturulabileceğini de göstermektedir.
Bu sentetik fibröz polimerlerin birkaç dezavantajı arasında istenen şeklin verilmesindeki güçlük, ve hücre adhezyonunu güçleştiren hidrofobik yapıda olmaları sayılabilir. Hücreleri yapışmasında güçlük demek daha fazla sayıda hücreye ihtiyaç duymak demektir. Bu, klinik olarak büyük güçlük getirmektedir, çünkü otolog hücre temini için küçük miktarda kıkırdak biyopsisi alınabilmektedir ve az miktarda hücre, kültürde çoğaltılmak zorundadır. Bunun yanı sıra, bu tip polimerler, immun kompetan hayvanlarda subkutan lokalizasyon gibi vasküler kompartmanlara implante edildiklerinde güçlü bir yabancı cisim reaksiyonu oluşturmaktadırlar. Bu immun yanıtın histolojik incelemesinde gözlenenler tıpkı polyester sütür materyaline olan reaksiyon gibidir.

b)Geçirgen Biyolojik İskeletler
Kıkırdak için biyolojik iskelet olarak ekstrasellüler matrikste de yoğun olarak bulunan kollajen kullanılmaktadır. Kollajen süngerler geçirgen, biyouyumlu ve biyoyıkılabilir özelliği nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Kollajen ve kollagen glikozaminoglikan iskeletlerin hazırlanışı hakkında çok sayıda bilgi literatürde mevcuttur. Genelde hayvan dokularından elde edilmektedir. En sık sığır tendonundan elde edilen tip 1 kollajen kullanılmaktadır.
Sentetik kafes iskeletler ile kıyaslandıklarında kollagen iskeletin kollajen üretimini, sentetik PGA’in de proteoglikan sentezini uyardığı gözlenmiştir. Buna ek olarak süngerin delikli yapısı ve yüzey özelikleri de hücre gelişimin ve kıkırdak oluşumunun önemli birer uyaranıdır. Kondrosit gelişimi ve ekstrasellüler matriks oluşumunun uyarılması için kollajen süngerler üzerine büyüme faktörlerinin örneğin basic FGFnin eklendiği çalışmalarda kondrosit dışı hücrelerin kondrositlere farklılaşmasını uyardığı saptanmıştır.
Hyaluronan, gelişen embriyonun andiferansiye mezenşiminde ve kıkırdak ekstrasellüler matriksinde geniş yer tutan bir maddedir ve en önemli özelliği, gelişmekte olan mezenşimal hücrelerin kondrositlere farklılaşmasını uyarmasıdır. Bunun yanı sıra kondrosit fonksiyonlarını etkileyen fiziksel mikro çevrede önemli rolü olduğu düşünülmektedir. Solchoga’nın yaptığı bir çalışmada (13) tavşan kondilinde osteokondran bir defektin onarımı için hyaluronan fragmanları kullanılmış ve polimer süngerlerin kullanıldığı kontrol grubuna göre daha yüksek çoğalma hızı kaydetmiştir.

c)Hidrojel iskeletler
Hidrojeller, üç boyutlu yapılarını uygun koşullarda koruya jelatinöz kolloidler olup çözünebilen bir polimerin su ile karıştırılması ve ortama çapraz bağlara sahip ajanın eklenmesi ile elde edilirler. Polimer jeller gibi şekillendirilebilirler, daha büyük avantajları ise enjekte edilebilmeleridir. Hidrojellerin hücrelerin immobilizasyonu için uygun üç boyutlu destek matriks sağlayabildikleri kanıtlanmıştır. Hidrojellere örnek olarak iyonlarla çapraz bağlı aljinatlar ve çitosan , pluronikler gibi hidrojen bağlı blok ko-polimerler, (PEO –polietilen oksit- ve PPO’nun (polipilen oksit) ko-polimerleridir) ve çok sık kullanılan fibrin glue sayılabilir.
Hidrojellerin kullanımını kısıtlayan sorunların başında özellikle enjekte edilen formlar için mekanik ve şekil özelliklerini uzun süre koruyamamalarıdır. Örneğin pluroniklerle oluşturulan jellerin yük altında bütünlüklerini kaybedebildikleri bilinmektedir.

Doku mühendisliği ile geliştirilen kıkırdak dokusunun biyolojik ve biyomekanik özelliklerini daha uygun hale getirmek için 1- Ekstrasellüler kıkırdak matriksinin biyolojik özelliklerinin iyileştirilmesi 2- Geliştirilen kıkırdağa iç destek sağlamak 3- Pseudo perikondriyum gibi bir dış destek sağlamak gibi girişimler denenmektedir. Bunların yanı sıra kondrosit gelişimini arttıracak, ekstrasellüler matriks sentezini hızlandıracak büyüme faktörlerinin ortama eklenmesine yönelik çok sayıda çalışma mevcuttur.

Doku Mühendisliği

Doku Mühendisliği
Yazar: Prof. Dr. Kutlu Sevin

İlgili Konular

Yasal Uyarı

Doku Mühendisliği

Doku Mühendisliği Yazar: Prof. Dr. Kutlu Sevin

İlgili Konular

Yasal Uyarı

Doku Mühendisliği
Yazar: Prof. Dr. Kutlu Sevin